El mecanismo de la PCR

La reacción en cadena de la polimerasa es un sistema para un único tubo de ensayo para replicación de ADN que permite que una secuencia de ADN determinada sea amplificada de modo selectivo o enriquecida varios millones de veces en unas pocas horas. Dentro de una célula que se encuentra en división activa, la replicación comprende una serie de reacciones mediadas por enzimas que resulta en una copia fiel del genoma completo. Dentro de un único tubo de reacción, la PCR utiliza sólo una enzima indispensable, la Taq polimerasa, para amplificar una fracción específica del genoma a temperaturas en las cuales el ADN todavía permanece como cadenas simples.

Durante la replicación del ADN celular, las enzimas primero desenrollan y desnaturalizan la doble hélice del ADN para generar ADN de simple cadena. Luego, la ARN polimerasa sintetiza un pequeño tramo de ARN complementario a una de las cadenas de ADN al comienzo del sitio de replicación. Este complejo ADN-ARN sirve de sitio de iniciación para la unión de la ADN polimerasa, la enzima que produce la cadena complementaria de ADN. Durante la PCR, se utilizan altas temperaturas para lograr que las moléculas se separen en cadenas simples. Secuencias de ADN de simple cadena sintéticas de 20 a 30 nucleótidos se utilizan como iniciadores de la replicación. Dos secuencias de iniciadores diferentes se utilizan para restringir la región que va a ser amplificada. Un iniciador es complementario a una cadena de ADN al comienzo de la zona de interés; el segundo iniciador es complementario a la secuencia en el ADN de la cadena opuesta al final de la zona de interés.

Cuando se realiza una reacción de PCR, se agrega una pequeña cantidad del ADN de interés a un tubo de ensayo que contiene una solución reguladora con la Taq polimerasa, los cuatro nucleótidos, los iniciadores y el cofactor de la enzima, cloruro de magnesio. La mezcla de la reacción es llevada a través de varios ciclos de replicación que consisten en:

1. Un ciclo de uno a varios minutos a 94-96 ºC, durante la cual el ADN se desnaturaliza y se separa la doble hélice en las cadenas simples de ADN.


2. Un ciclo de uno a varios minutos a 50-65 ºC durante el cual los iniciadores se unen (mediante puentes de hidrógeno) a sus secuencias complementarias a cada lado de la secuencia en cuestión.


3. Un ciclo de uno a varios minutos a 72 ºC, durante el cual la Taq polimerasa se une y extiende la cadena complementaria de ADN entre cada iniciador. La clave de este paso es que esta polimerasa específica puede ser activa a esta temperatura, cualidad que otras polimerasas no poseen (las polimerasas presentes en otros organismos se inactivan a altas temperaturas).

A medida que la amplificación continúa, la secuencia de ADN que se encuentra entre los iniciadores se duplica luego de cada ciclo de replicación. Luego de treinta de estos ciclos, se alcanza un factor de amplificación teórico de mil millones.

Entre las innovaciones más recientes con respecto a esta técnica, se han desarrollado cicladores térmicos (se denominan así los dispositivos preparados especialmente para llevar a cabo la PCR) que son controladores directamente por una computadora, para controlar los repetidos cambios de temperatura que requiere la PCR.

Luego de la amplificación, los productos obtenidos, en general, son sometidos a una electroforesis en geles de agarosa. Debido a que la electroforesis puede generar cantidades de productos de alrededor de microgramos, los fragmentos obtenidos pueden visualizarse fácilmente en los geles luego de una tinción con algún colorante para ADN, como el bromuro de etidio. Si bien las amplificaciones logradas son sorprendentes, debe recordarse el punto más importante que es que la amplificación es selectiva, sólo la secuencia de ADN localizada entre los iniciadores es amplificada exponencialmente. El resto del genoma no es amplificado y permanece invisible en el gel. Estos geles se realizan siempre porque debe chequearse el producto obtenido en la PCR. Lo que se controla es que haya producto formado, que tenga el tamaño correcto y que no haya más de una secuencia que ha sido amplificada.