Técnicas previas a la PCR

La química detrás de la PCR depende de la complementariedad de las bases de ADN. Todos los métodos previos de análisis del ADN también se basaron en este hecho. Cuando una molécula de ADN es calentada lo suficiente, los enlaces puente de hidrógeno que mantienen unidos las dos cadenas de la doble hélice del ADN se rompen y la molécula se desnaturaliza en cadenas simples de ADN. Si se permite que la solución de ADN se enfríe, entonces los pares de bases complementarios pueden reunirse (la molécula se renaturaliza) y se restablece la doble hélice.

Experimentos realizados en la década de 1960 mostraron que muchas secuencias de ADN se encontraban repetidas dentro del genoma. Con esa información, los científicos tomaron soluciones de ADN purificado, las desnaturalizaron por calor y luego permitieron que se enfriaran. Mediante el uso de técnicas espectrofotométricas, fue posible controlar la velocidad a la que el ADN se renaturalizaba. Los datos de estos estudios revelaron que el genoma estaba compuesto de diferentes clases de secuencias de ADN que podían distinguirse por la frecuencia de su repetición. Por ejemplo, algunas células de anfibios contienen más ADN que las células humanas, debido a la gran cantidad de ADN repetitivo en relación con sus congéneres humanos.

Si bien esta metodología fue muy útil para estudiar los rasgos generales de la organización del genoma, no permitía estudiar la estructura de cada gen individualmente. La capacidad para analizar cada gen individualmente se logró durante los años setenta luego de la introducción del análisis mediante el uso de enzimas restricción y técnicas de hibridización de ácidos nucleicos. Se estima que el genoma humano posee entre 100.000 y 200.000 genes. Para focalizarse en un gen determinado, el ADN del organismo en cuestión debía ser aislado, fragmentado con enzimas de restricción y separado con una electroforesis en geles de agarosa. Los fragmentos de ADN luego son desnaturalizados para obtener ADN de simple cadena y son expuestos a una solución que posee una “sonda” radiactiva de ADN. La sonda consiste en ADN de simple cadena (ya sea ADN o ARN) con una secuencia elegida para unirse al gen de interés. Bajo condiciones apropiadas de temperatura, pH y concentración de sales, la sonda se une a su correspondiente secuencia del ADN en cuestión y sólo allí. La presencia de la señal radiactiva (en general en un film sensible a rayos X) indica la presencia de sitios de unión a la sonda.